在巴西不同农业生态系统生长下的转基因玉米的蛋白组学比较分析

Comparative proteomic analysis of genetically modified maize grown under different agro-ecosystems conditions in Brazil

 

来 源：Proteome Science 2013,11:46

作 者: Sarah Zanon Agapito-Tenfen et al.

编 译：雷元华

 

背 景：即使对细胞组分的特性还不甚明了，但仍能利用展示技术对上千细胞组分进行测量比较。在这项研究中，作者利用双向凝胶电泳结合质谱分析对不同农业生态系统生长下的巴西转基因杂交玉米进行蛋白组学分析，同时选用近缘非转基因杂交玉米作为对比对象。

关键字：展示技术； 转基因； 双向凝胶电泳； 蛋白组学

结 果：在第一阶段的分析中，数据变化的主要来源是通过主成分分析法分析不同农业生态系统条件下确定的变量。通过对比分析在不同农场里的转基因与非转基因玉米一共有32种不同的蛋白。经鉴定，它们的主要分子功能是糖与能量代谢、基因信息处理和应激应答。

结 论：这项研究取得了在大田条件下巴西MON810转基因杂交玉米表达的不同蛋白的第一手资料。随着“组学”数据的全球化，这或许能够为生物安全评估提供一个理想的标准。

1.背景介绍

转基因生物已存在于许多国家，甚至进入了消费阶段。从农业生物技术应用国际收购服务机构了解到，2012年转基因作物的种植面积已经达到了1亿7千万公顷，主要包括有大豆、玉米和棉花。

尽管许多国家已经广泛应用了转基因生物，但生物安全研究的必要性依然存在。遗憾的是，缺乏严格的执行标准、国际间的协调、政策信息的透明度及有关生物安全数据的保密，使得管理工作十分艰难。

已有报道通过蛋白组学和转录组学对转基因作物的非靶标效应进行过评估。展示技术如蛋白组学，即使对大量植物组分特性不了解也能对它们进行测量比对。这或许能得到转基因的非靶标效应，但在进行转基因的非靶标效应检测时，需要一个比靶标实验更加综合的方法。

众所周知，植物受环境的影响会产生相当大的变化。MON810，转基因玉米，和其他作物一样，会受到不同环境条件和农业管理措施的影响。深入了解基因表达的变化能够很好的解答由“组学”实验得到的研究成果。实验应该对不同条件下生长的植物进行研究，以期得到尽可能完整的综合结果，如不同的生长地、气候条件、年收获情况和农田管理措施。在一组不同环境与培养条件下对比转基因植物及其近缘种是十分可行的。

但蛋白组学和其他非靶标展示技术在转基因植物风险评估应用上常常受到质疑，因为它们对所得的数据难以做出一个清晰明确的解释，而且传统的培育方式和环境影响比遗传工程产生的变量更多。

在这项研究中，作者通过蛋白组学展示技术对生长在巴西不同农业生态系统条件下的转基因杂交玉米进行蛋白质表达的分析。选用的MON810杂交玉米在巴西属于广泛种植种，实验地点为坎普斯诺乌斯和沙培科，两地作物的种植同步。

2.结果与讨论

此次研究作者对大田条件下的转基因杂交玉米的抗虫蛋白进行了评估。实验选用了一个含单嵌入片段GMP32R48YG的杂交玉米（MON810项目，玉米改良种），对比对象选用其近缘非转基因杂交玉米P32R48。

2.1主成分分析法

主成分分析(PCA)可以说明在不同凝胶带间相似的蛋白量。作者进行了三组PCA测试：1）对来自同一生长地的转基因与非转基因凝胶带做对比，分析其生化差异和理化差异；2）分别对比来自两个实验地点的转基因凝胶带和非转基因凝胶带，分析不同环境因子对作物的影响；3）将所有凝胶带一起分析，尝试能否获得基因型与环境交叉效应的数据。尽管这样，当对来自不同地点的凝胶带进行比较时，一些技术性的变量依然有可能会受到某些不确定因素的干扰。

依据主成分分析得到差异量，主要的变异原因是环境因素、基因型和来自生物学和技术性的变化。当所有的凝胶带汇聚在一起时，坎普斯诺乌斯组的样本与沙培科存在分离现象，但在两个实验地点的非转基因作物都差异比较小。与此相反，沙培科的转基因植物和坎普斯诺乌斯的植物差异很大。因此，转基因植物的基因表达更多的是受到环境因子的影响。

2.2蛋白组学分析

通过质谱鉴定得到32个显著差异的蛋白。坎普斯诺乌斯组不同表达蛋白有16个，沙培科有16个。通过Gene Ontology数据库鉴定，它们主要参与的是：1）糖和能量代谢；2）基因信息表达；3）应激应答。

坎普斯诺乌斯试验组中有8个蛋白仅在转基因组中存在，另外8个在转基因中没有出现。在沙培科实验组中，有7个蛋白转基因独有，另外7个存在于非转基因组，最后两个在转基因与非转基因杂交种中表现出定量的差异。一个是伴侣蛋白，一个是2-Cys BAS1蛋白，分别在非转基因和转基因组内呈上调状态。

2.3糖能代谢相关蛋白

参与的蛋白有15个，分成5个蛋白组参与了以下代谢过程：1）糖的降解及合成；2）光合磷酸化；3）卡尔文循环；4）丙酮酸脂代谢；5）淀粉合成。

属于3磷酸甘油醛(GAPDH)的点有3个，果糖醛缩酶有4个。这些酶在各个处理组间都存在，包括两个生长地点的转基因或非转基因组。早先也有报道表明MON810品种在大田条件下生长的叶蛋白中的GAPDH有下调现象。

另外有三个蛋白是参与了光合磷酸化反应。它们直接参与了能量代谢过程，包括氧还原（铁氧还原蛋白辅酶Ⅱ，仅在坎普斯诺乌斯的转基因植物中存在）、电子传递（H运输ATP合成酶，只在沙培科组的转基因植物内有）和钙离子的结合（类囊体腔内的19kDa蛋白，只存在于坎普斯诺乌斯的非转基因组）。早先也报道MON810核内蛋白的对比研究中发现，氧化还原类蛋白常出现上调或下调的现象。

2.4应激反应蛋白

应激诱导的蛋白同样在非转基因组内与转基因组内观察到。它们可以分为5类蛋白。

检测到它们分别是：有关谷胱甘肽代谢(乙二醛酶1，IN2-1)、过氧化物酶家族(过氧化物酶42前体，APx1)、病程相关蛋白(PR10)，这些仅在非转基因中观察到。

在其他一些研究中也有报道在转基因与非转基因的对比中发现，应激诱导释放的蛋白表达水平存在差异。Coll等2010年利用微阵列平台检测在大田条件下，转基因玉米MON810和它对应的非转基因种的叶内转录的不同。作者注意到在转基因植物中，谷胱甘肽相关代谢蛋白（谷胱甘肽-S-转移酶蛋白）存在过量表达。此外，Zollaet等发现谷胱甘肽过氧化酶蛋白只在MON810中存在。其他作者也检测了其他应激诱导释放的蛋白，有两个在转基因有过量表达现象（铁蛋白和脱水蛋白），另外有一个只在非转基因植物中出现（富集蛋白）。另一个层次上的应激诱导释放的蛋白，热休克蛋白，在MON810中也发现有下调现象。

研究中发现，在两个地点的转基因组中都发现有2-半胱氨酸氧化还原蛋白BAS1（2-CP）蛋白有过量表达的现象。

2.5遗传信息处理蛋白

在我们的检测中，有关遗传信息处理蛋白有四个。其中有两个只在坎普斯诺乌斯的转基因组存在，包括腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APT)、ATP依赖Clp蛋白酶ATP耦合单元ClpA(Clp-ClpA)。APT在植物中的腺嘌呤代谢中起着关键酶的重要作用。而Clp-ClpA的家族成员会与特定底物反应发挥其解折叠酶的作用。

剩下的两个有关基因信息处理的蛋白在沙培科非转基因组内观察到，呈上调状态（伴侣蛋白和腺苷甲硫氨酸合成酶1）。

2.6“组学”与转基因安全评估

很多研究使用“组学”作为潜在风险的评估工具，但作为生物安全评价的一种科技手段它还远未达成实用性和适用性上的要求。

这些技术的核心是对比有安全使用历史的转基因作物与其对应的非转基因作物。展示技术的实用性上已有过讨论，尤其是当科学、合法的耐胁迫转基因作物在相应的胁迫条件下比常规种生长的差或不生长时，对于两者生理功能的直接比较并不合适，而通过它们的分子组分来检测其非靶标变化或许是唯一的方法。

在过去的几年里，大量研究开始关注植物转基因转化和表达的非靶标效应，很多是基于一般的“组学”技术。但这些研究依旧无法得到一致的结果，因为使用不同遗传背景或生长条件同样会出现变异，而且和使用组学技术里出现的变异一样，都难以确定。

所以，本研究的目的是对转基因植物因遗传背景或环境变化所产生的变异做一个更深入了解。为了评估转基因玉米在不同农业生态系统下的蛋白质组，作者检测到了一些与各种生理功能有关的蛋白质，主要可以分为三类：糖与能力代谢、基因信息处理、应激反应。在这些检测到的蛋白中，60%参与了同样的代谢过程，两个生长地点都有。不过，这些蛋白也有在其他研究中被检测到。综合这些研究的结果表明蛋白家族参与了类似的代谢过程。值得注意的是这些研究采用了相同的转基因杂交作物，但实验生境各异（表1）。

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